查五世任內亦出現咗宗教改革嘅浪潮。早喺1413年波希米亞人胡斯就提出咗反對教廷濫發贖罪劵斂財嘅手段,但就被教廷視為異端,將佢開除教籍同埋施以火刑。
喺接近一百年後,比查五世年長十幾歲嘅德國教士馬丁・路德讀咗胡斯嘅著作,於是喺1517年10月31日,喺當地教會嘅門上貼出九十五條論綱,列出反對贖罪券嘅九十五個論點。
95條原文用拉丁文寫成,但好快被翻譯成德文並透過當時啱啱開始盛行嘅印刷術風行起嚟,立刻傳遍咗整個歐洲。路德嘅想法引起咗好大嘅迴響,連好多德意志領主都改信咗路德宗。事實上德意志嘅領主見到教會靠賣贖罪劵發過豬頭,早已經睇唔過眼,認為民脂民膏被教會刮曬,自己咸豆都冇得食。
而除咗路德宗之外,法國亦出現咗加爾文教派,加上原來嘅胡斯派,統稱基督新教。
查五世作為天主教嘅擁護者,強烈反對路德等人嘅主張。1521年,佢以皇帝嘅身份傳召路德參加沃爾姆斯宗教會議,會上查五世宣佈路德及其追隨者為非法(1521年沃爾姆斯敕令)。
而德意志諸侯本嚟就唔多聽神羅枝笛,今次有咗大義名份就更加唔聽話。1531年由兩個實力最強嘅新教諸侯黑森伯爵同埋薩克森選帝侯組成咗施馬爾卡爾登聯盟,協定新教盟友如果受到查五世攻擊,其他盟友要出兵幫拖。
由於脫離天主教會能夠帶來顯著嘅經濟利益,陸續有其他諸同帝國自由市加盟,聲勢越嚟越大。
查五世喺聯盟成立嘅最初15年,因為忙於同鄂圖曼和法國打仗,未有時間教訓佢哋。但到咗1546年路德死後,查五世終於決定出兵。1547年,神羅軍擊敗咗新教聯軍,黑森伯爵更加俾佢俘虜咗。但過咗幾年後,新教聯盟得到法國嘅支持,展開咗第二次施馬爾卡爾登戰爭。
第二次嘅抗爭以新教聯軍勝利告終,查五世為咗集中法力對付宿敵法國,同盟軍議和簽署咗奧格斯堡和約。查五世作出妥協,允許新教諸侯自由決定領土上信天主教定新教,給予路德宗喺神羅帝國嘅合法地位,但加爾文同胡斯派仍然係非法。