黐撚線AI教我點樣編輯人類基因

CCR5基因雙等位敲除：CRISPR-Cas9實驗操作指引

此流程以人類細胞（如HEK293或iPS細胞）為例，目標是將兩個CCR5等位基因（即CCR5+/+細胞）都敲除：

1. 實驗前準備

設計gRNA：選擇CCR5基因編碼區（Exon），設計2條（或以上）針對關鍵編碼片段的gRNA。確保靠近PAM序列（一般選NGG）。

合成gRNA和Cas9載體：可選用質體、病毒載體，或買商用gRNA和Cas9蛋白。

2. 實驗步驟

(A) gRNA設計與驗證

在線上設計工具（如Benchling、CRISPOR）選高效gRNA。

篩選off-target效應低、標的位點保守性高者。

(B) 複合體製備

gRNA與Cas9蛋白直接混合，或構建gRNA-Cas9表達質體。

(C) 細胞轉染

選擇適合細胞的轉染方法：電穿孔、脂質體法或病毒感染。

轉染gRNA/Cas9複合物入細胞。

(D) 敲除確認

約48-72小時後，提取基因組DNA。

PCR擴增目標片段，Sanger測序或T7E1酶解分析。

若敲除效率低，考慮單細胞分離（有限稀釋）、單克隆挑選。

(E) 雙等位敲除篩選

單細胞培養、擴增後再次檢測基因組DNA，進行PCR、定序，確認CCR5基因兩條等位基因均含插入/缺失突變（frameshift）。

可用流式細胞儀檢測CCR5蛋白表達消失（免疫螢光標記法）。

3. 建議及注意事項

同時用2條gRNA可提高敲除效率（雙gRNA刪除大片段）。

關鍵篩查：一定要確認單細胞來源的克隆，確保兩個等位基因都敲除而非嵌合體。

注意off-target效應，建議後續用全基因組定序或重要位點分析。

CCR5 基因雙等位敲除：詳細 CRISPR-Cas9 實驗操作步驟
以下流程示範於人類 HEK293T 或 iPSC 細胞株，重點在同時敲除兩條 CCR5 等位基因（CCR5–/–）。全程約需 3–4 週，含設計、轉染、篩選及驗證。
一、試劑與耗材準備
• Cas9 表達質體（如 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9）或 Cas9 蛋白
• gRNA 表達質體（U6 啟動子驅動）或合成 gRNA
• 兩對 CCR5 特異性 sgRNA 序列（各含 20 nt 序列，鄰近 NGG PAM）
• DNA 實驗級試劑：
– Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 或 Phusion 高保真酶
– PCR 引物：
• CCR5 外圍放大對（~500 bp）
• Sanger 測序引物
– T7E1 核酸酶試劑盒
– 細胞裂解液及純化試劑
• 細胞培養耗材：
– 培養基（DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep）
– 電穿孔或脂質體轉染試劑（如 Lipofectamine 3000）
– 6-well 板、24-well板、96-well板
• 單細胞分離系統：有限稀釋或流式細胞儀單細胞分選
• 流式細胞儀用抗 CCR5 抗體
• 無菌操作台、CO₂ 培養箱
二、設計與構建 gRNA
1. 目標區域選擇
a. 在 CCR5 第 2 外顯子（Exon 2）範圍內挑選兩個相隔約 100–300 bp 的目標序列，保證生成大片段刪除。
b. 使用 Benchling 或 CRISPOR 評估 on-target 效率與 off-target 風險。
2. gRNA 序列示例
• sgRNA1: 5’-GAGCATAGTGTCTGGAAGGT-3’（PAM: AGG）
• sgRNA2: 5’-CCTCAGGACATACACAGTTT-3’（PAM: TGG）
3. 構建質體
a. 在 pX330 或等效質體上，分別插入 sgRNA1、sgRNA2。
b. 轉化大腸桿菌，挑取單菌落，質體抽提並 Sanger 測序確認序列正確。
三、細胞轉染
1. 種板
• 前一天將 HEK293T 細胞接種於 6-well 板，每孔 2×10^5 cells，48 小時後達 70–80% 匯合。
2. 轉染條件
a. 脂質體法（Lipofectamine 3000 為例）：
• 每孔：
• Cas9-sgRNA1 質體：500 ng
• Cas9-sgRNA2 質體：500 ng
• P3000 試劑：2 µl
• Lipofectamine 3000：3 µl
• 於 Opti-MEM 中稀釋後，室溫孵育 10 分鐘，再加入細胞。
b. 電穿孔（Neon Transfection）：
• 參考儀器說明書設定：1,200 V；20 ms；2 脈衝，使用 R buffer。
• 2×10^5 cells，與質體共轉染。
3. 轉染後
• 24 小時後更換新鮮培養基；
• 48–72 小時後收集細胞，進行基因組 DNA 提取。
四、初篩與敲除效率檢測
1. PCR 擴增
• 用 Q5 高保真酶擴增 CCR5 目標片段（~500 bp）。
• PCR 條件示例：
– 98 °C 30 s；
– 98 °C 10 s, 60 °C 20 s, 72 °C 30 s，共 35 cycles；
– 72 °C 2 min，保溫。
2. T7E1 酶切分析
a. 將 PCR 產物變性後重退火，使雙鏈雜合。
b. 加入 T7E1，37 °C 消化 30 min；
c. 膠電泳：若有切割條帶，代表產生 INDEL。
3. Sanger 測序
• 將 PCR 產物純化後送測；
• 比對序列，定量不同突變類型及頻率。
若敲除效率 ≥ 50%，可進入單克隆篩選；否則優化轉染條件或更換 gRNA。
五、單細胞分離與克隆擴增
1. 方法選擇
a. 有限稀釋：將細胞稀釋至 0.5 cell/well 於 96-well 板；
b. 流式分選：標記 GFP 或抗 CCR5 抗體，直接分選單細胞。
2. 克隆培養
• 各井補充 100 µl 完整培養基，每週更換；
• 約 2–3 週後長出可見克隆。
六、克隆驗證
1. 細胞收集與 DNA 提取
2. PCR + Sanger 測序
• 分析每株克隆的兩條等位基因突變序列；
• 確認均為 frameshift 或大片段缺失。
3. 流式細胞儀驗證
• 用抗-CCR5 標記（如 PE-conjugated 抗體），檢測表面蛋白表達；
• CCR5–/– 細胞應無信號。
七、功能驗證（選做）
• HIV 感染實驗：檢測 CCR5–/– 細胞對 Env-R5 HIV 病毒顆粒的抗性。
• 基因轉錄分析：qRT-PCR 比較敲除株與野生型的旁系基因表達變化。
注意事項
1. off-target 監測：挑選可能風險位點進行 PCR+測序；
2. 細胞多態性：同一細胞株不同批次表現可能有差異；
3. 安全性：全程遵守生物安全三級/二級實驗室規範。
此流程可重複套用於其它細胞系及動物胚胎注射，只需調整轉染或注射參數即可。最後務必做完整的分子與功能驗證，以確保真正獲得 CCR5 雙等位基因敲除細胞。